4. объект и методы исследований
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В качестве объекта исследований были использованы перезимовавшие имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. Сбор проводился в 40 локальных популяциях 32-х районов Башкортостана (рис. 1).
Рис. 1. Карта обследованных локальных популяций колорадского жука.
ЛС – лесостепная зона, С – степная, ГЛ – горно-лесная. Агропочвенное деление территории дано по (Атлас республики Башкортостан, 1992).
Оценку чувствительности имаго к пиретроидам (дельтаметрин, децис КЭ 2.5 г/л), фосфорорганическим инсектицидам (ФОИ: малатион, карбофос СП 100 г/кг), неоникотиноидам (тиаметоксам, актара ВДГ 250 г/кг; ацетамиприд, моспилан РП 200 г/кг) проводили топикально предварительно установленными диагностическими концентрациями (ДК) в дозе 1 мкл/особь. По результатам учётов смертности на 3-и сутки определяли соотношение чувствительных и устойчивых к каждому препарату особей в локальных популяциях.
Для анализа фенетического полиморфизма использовали фены рисунка темени, 5 вариаций (Климец, 1988; Беньковская с соавт., 2004), затылка, 3 вариации (Беньковская с соавт., 2004), пронотума, 9 вариаций, (Фасулати, 1985, 1986) и элитр, 5 вариаций (Климец, 1988; Беньковская с соавт., 2004) (рис.2).
Рис. 2. Фены рисунков отделов тела имаго Leptinotarsa decemlineata.
А – вариации фена темени, Б – затылка, В – пронотума, Г – элитр.
Для выделения ДНК использовали живых и фиксированных в 96%-ном этаноле имаго. В случае живых имаго ДНК выделяли из простерилизованных лапок (Сидоренко, Березовская, 2000). Выделение проводили методом экстракции смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ (Chomezynski, Sacchi, 1987). Амплификацию ДНК проводили методом ПЦР (Saiki et al., 1988) в амплификаторе “Терцик” (ДНК-Технология, Россия). Фрагмент гена COI мтДНК амплифицировали по Hebert (Hebert et al., 2003). Идентификацию нуклеотидной мутации 980A>G гена AChE проводили методом bi-PASA (Clark et al., 2001). Обработку ДНК ферментами рестрикции проводили при условиях, рекомендованных производителями (СибЭнзим, Россия). Для электрофоретического фракционирования препаратов ДНК в зависимости от целей эксперимента использовали 0.8–2% агарозные или же 5–8% полиакриламидные гели. Определение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена COI проводили в автоматическом секвенаторе типа ABI PRISM™ 310 Genetic Analyser, Applied Biosystems в условиях, рекомендованных производителями.
Токсикологические данные обрабатывали с применением формулы Эббота (Abbot, 1925). Величины СК50, СК95 и ДК определяли методом пробит-анализа в модификации Миллера-Тейнтера (Беленький, 1963). Оценку внутрипопуляционного разнообразия проводили с использованием среднего числа вариаций m и доли редких вариаций h с их выборочными ошибками (Животовский, 1982). Для оценки межпопуляционных различий использовали показатель сходства популяций r (Животовский, 1982). Достоверность различий оценивали по критерию соответствия К. Пирсона c2 (Лакин, 1990).
Расчеты по всем приведённым показателям проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2002, (1985-2001, Microsoft Corporation). Дендрограммы взаимоотношений между локальными популяциями колорадского жука строили по значениям показателя r при помощи пакета компьютерных программ STATISTICA 5.0 (1984–1985, Statsoft, Inc.). Кластеризацию проводили по стратегии Варда, в качестве метрики использовали Евклидово расстояние. Рельефные поверхности, отображающие эпигенетический ландшафт популяции, строили при помощи компьютерной программы 3D Field 2.7.7.0 (1998 – 2005, Vladimir Galouchko). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена COI, подбор праймеров и рестриктаз осуществляли с помощью пакета компьютерных программ Lasergene 5.05 (1989-2002, “DNASTAR Inc.”, USA), а также программ PrimerPremier 5.00 (PREMIER Biosoft International) и Chromas 1.45 (1996-1998, Conor McCarthy, School of Health Science, Australia).
|
